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La preparazione di un campione.La preparazione di un campione è un passo fondamentale nell'analisi citologica. Dei buoni risultati finali si ottengono prestando attenzione alle fasi iniziali del processo. “Preparare un campione” vuol dire effettuare una serie di procedimenti atti a conservare nel tempo il substrato cellulare. Il tessuto vivo, una volta prelevato, tende ad autodistruggersi andando in contro ad una serie di processi che, a livello endocellulare, portano alla digestione progressiva di alcune strutture mediante fenomeni proteolitici. Il tessuto appena asportato, inoltre, viene privato di una serie di elementi necessari per la sua sopravvivenza. Le cellule, infatti, necessitano di nutrienti esogeni, di ossigeno, di segnali biochimici per poter sopravvivere e, inoltre, devono in qualche modo portare fuori i prodotti di scarto. Il tessuto asportato non è in grado di fornire alle proprie cellule tali nutrienti che, anche per questo motivo, cessano di vivere. In ultima analisi qualsiasi tessuto può venir danneggiato dall'azione dell'ossigeno dell'atmosfera che è un potente ossidante o essere preda di batteri o microorganismi vari. Alla luce di ciò si rende necessario “fissare” il campione. Fissare un campione vuol dire fare una “fotografia istantanea” e prevenire la degenerazione del tessuto. È un passo necessario per poter visualizzare, anche a distanza di tempo, il campione nella sua completezza. Un campione viene fissato a prescindere dal tipo di analisi realizzata o dagli strumenti necessario per poterla a termine. I successivi protocolli variano in base al tipo di indagine e al tipo di strumento che si intende utilizzare. L'analisi al microscopio ottico necessita di alcuni passaggi che servono a colorare il campione mediante molecole cromofore (portatrici di colore) che presentano una elevata affinità per il soggetto da rilevare. La colorazione di un campione rende possibile l'osservazione delle sue più piccole parti marcando, con gli opportuni coloranti, gli organuli o particolari agglomerati di biomolecole interne. Il microscopio elettronico a scansione, invece, non necessita di colorazione ma di un passaggio di copertura per rendere il bordo del preparato adatto alla repulsione degli elettroni.. La copertura di un campione, che si effettua nell'analisi con il microscopio elettronico a scansione, consiste nell'apporre uno strato di metallo pesante, quale l'oro od il palladio, per rendere possibile la repulsione degli elettroni lungo la superficie limite. Il metallo posto sopra il campione deve essere sufficientemente spesso da respingere gli elettroni ma, allo stesso tempo, deve evitare una copertura totale che potrebbe compromettere i rilievi dello stesso eliminando particolari dettagli che saranno apprezzati nella fase di osservazione. Nella fase di copertura di un campione per l'utilizzo con il microscopio elettronico il metallo viene nebulizzato sulla superficie preferibilmente in modo perpendicolare rendendo possibile la messa in risalto dei rilievi. Preparazione di un campione nella microscopia ottica.Prelievo.Il prelievo di un campione di tessuto consiste nell'asportazione di un piccolo frammento dall'animale, o della pianta, che possibilmente deve essere vivo o deceduto da poco tempo. Maggiore è il tempo intercorso tra il prelievo e la morte dell'animale maggiore sarà la degradazione del campione o la proliferazione batterica. Gli strumenti del prelievo sono, solitamente, il bisturi, l'ago aspirato, il raschietto oppure il tampone. Il bisturi è uno strumento chirurgico molto utilizzato formato da un manico e da una lama molto affilata. Mediante il bisturi è possibile sezionare una parte di tessuto la cui forma può essere varia. Con la tecnica dell'ago aspirato viene introdotto un ago di dimensione ridotta dentro il bersaglio da analizzare, solitamentei una ghiandola quale la tiroide od il testicolo, con lo scopo di aspirare il suo prodotto di sintesi, o eventualmente dell'essudato. L'ago aspirato è un esame invasivo in quanto si rende necessaria la penetrazione epiteliale. Mediante il raschiamento è possibile staccare piccoli frammenti di tessuto epiteliale formati da pochi strati cellulari. La tecnica del raschiamento è utilizzata in ginecologia nell'esame del pap-test. Fissazione.Subito dopo il prelievo è necessario “immobilizzare” il tessuto per i motivi che abbiamo già illustrato. Immobilizzare il campione vuol dire bloccare i processi autolitici della cellula. Per la microscopia ottica si utilizzano metodi fissativi fisici e chimici e la scelta viene operata in base al tipo di studio ed al tipo di tessuto da analizzare. La “forza” di determinati fissativi, intesa come la capacità chimica di degradare le molecole, potrebbe irrimediabilmente compromettere il campione rendendolo inutilizzabile. Fissazione con metodi fisici.I metodo fisici per bloccare la degradazione tissutale possono essere riassunti in tecniche che usano: Il calore Il freddo Le microonde Il calore è un mezzo fisico drastico che attua il proprio lavoro su due fronti. Da un lato viene tolta parte dell'acqua presente nel tessuto (disidratazione parziale) mentre dall'altro si modifica la struttura quaternaria delle proteine, ovvero il loro ripiegamento tridimensionale, per cui buona parte del complesso endocellulare delle proteasi viene inibito. Gli strisci di tessuto sanguigno possono essere fissati mediante l'utilizzo del calore. Mediante le microonde si operano dei processi fisici molto simili a quelli prodotti dal calore. Le microonde sono radiazioni elettromagnetiche ad altissima frequenza e bassa energia. La frequenza si attesta a circa 2,4GHZ mentre l' energia assorbita dal sistema generatore arriva al massimo ad 2-4kW. Nonostante gli alti indici l'alta frequenza fa si che a pochi centimetri dall'emettitore, che generalmente è un “magnetron” di brevetto statunitense, sia apprezzabile un campo energetico non capace di ionizzare le molecole, ovvero strappare loro degli idrogeni o degli elettroni dal guscio atomico, modificandone in questo modo le caratteristiche fisico-chimiche. Il principio del microonde è semplice. La radiazione colpisce le molecole di acqua presenti nel tessuto e, in minor parte, alcuni gruppi di proteine, acidi grassi e lipidi. Queste molecole vibrano ed il movimento di frizione contro altri composti, unito agli eventuali urti nel sistema, produce calore. Di per sé le microonde non sono ionizzanti e, per questo motivo, non rompono i legami chimici delle molecole. Il folding delle proteine non dovrebbe modificarsi ma, in realtà, è ipotizzabile che l'alta temperatura raggiunta dal processo possa denaturare il ripiegamento tridimensionale dei peptidi. Il freddo non è un vero e proprio mezzo di fissazione. Se un campione viene congelato e poi scongelato i fenomeni ossidativi e litici avvengono comunque. Fino a quando il campione rimane sotto bassa temperatura, meglio se prossima allo zero assoluto, questo non si degrada per cui sarebbe più opportuno definire il metodo fisico del freddo come metodo conservativo. Freeze drying dei tessuti biologici.Mediante la tecnica del congelamento-essiccazione (freeze drying per usare i termini inglesi) è possibile conservare a temperatura molto bassa un campione di tessuto. La procedura per effettuare il congelamento e la seguente essiccazione è la seguente: Congelamento ultrarapido del tessuto a temperatura di circa -160° C. A questo valore l'acqua si trasforma in ghiaccio senza la formazione di cristalli che potrebbero inficiare sulla struttura cellulare Essiccazione del tessuto che viene esposto a temperature di circa -40°C. La colorazione, che avviene dopo l'inclusione, dei tessuti processati avviene mediante l'utilizzo di particolari coloranti nebulizzati sul substrato. È importante comprendere che il rapido congelamento del campione ottenuto mediante una temperatura inferiore ai -150°C non permette all'acqua di formare cristalli che potrebbero danneggiare la struttura del tessuto. L'acqua, infatti, ha una proprietà particolare per la quale alle basse temperature tende ad espandere il proprio volume e questa peculiarità potrebbe causare del danno meccanico endocellulare. Fissazione con metodi chimici.L'utilizzo di fissativi chimici rappresenta la tecnica che spesso viene utilizzata nella preparazione di un campione. I fissativi chimici sono classificabili in due grandi gruppi: i fissativi primari ed i fissativi secondari. Fissativi chimici primari.Quando una molecola è capace, da sola, di operare la fissazione si parla di fissativo primario. Alla categoria appartengono acidi forti come l'acido tricloroacetico (Cl3C-COOH), l'acido trifluoroacetico (F3C-COOH) e meno forti come l'acido acetico (CH3-COOH) oltre che a molecole polari come l'etanolo (CH3CH2OH) o il metanolo (CH3OH). Fissativi chimici secondari.I fissativi chimici secondari da soli non sono capaci di fissare la struttura proteica della cellula ma servono per potenziare l'azione dei fissativi primari qualora questi non fossero efficienti nei confronti di alcune strutture endocellulari. La colorazione.La colorazione è un processo molto importante che si effettua durante la preparazione di un campione per l'osservazione al microscopio ottico. Un buona colorazione, infatti, si traduce in una buona visualizzazione in fase di analisi mentre con una colorazione blanda, o poco accurata, è possibile che i risultati ottenuti in analisi possano essere fuorvianti.
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